HiFi-MMLV cDNAdi一鏈合成試劑盒
HiFi-MMLV cDNA Kit
目錄號(hào)：K0744
保存條件：-20℃保存。
組分說明
組分說明
Cat. No. K0744 K0744A
Kit Size 25 100
HiFi-MMLV，200 U/μl 25 μl 100 μl
5×RT Buffer 120 μl 500 μl
Primer Mix 60 μl 240 μl
dNTP Mix，2.5 mM Each 120 μl 500 μl
DTT，0.1 M 60 μl 240 μl
RNase-Free Water 1 ml 1 ml
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品是專為兩步法RT-PCRdi一步實(shí)驗(yàn)配制的cDNAdi一鏈合成試劑盒。本產(chǎn)品包
含從RNA模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNAdi一鏈所需的所有試劑，其中包括HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、
反應(yīng)緩沖液、引物、dNTP等。經(jīng)過突變改造的HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶RNase H活性缺失，
減少了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中RNA的降解，更容易獲得全長(zhǎng)的cDNA。HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)
定性強(qiáng)，可得高產(chǎn)量的 cDNA，使用簡(jiǎn)單方便。本系統(tǒng)對(duì)后續(xù)的 PCR以及定量PCR試
驗(yàn)兼容性高，適用各種PCR反應(yīng)的DNA聚合酶。
產(chǎn)品特點(diǎn)
·RNase H-：經(jīng)突變的HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，RNase H活性缺失，更易獲得全長(zhǎng)cDNA。
·使用方便：試劑盒包含除RNA模板外的逆轉(zhuǎn)錄所需全部試劑。
注意事項(xiàng)
1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染，建議在專門
的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)
常更換手套。
2．實(shí)驗(yàn)盡量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，應(yīng)使用0.1％DEPC（焦碳酸二乙
酯）水溶液在37℃處理12小時(shí)，并在120℃下高壓滅菌30分鐘后使用，或者將玻璃
器皿在180℃下干熱滅菌60分鐘后使用。實(shí)驗(yàn)中用到的無菌水應(yīng)使用 0.1%的DEPC
處理后進(jìn)行高壓滅菌。
3．本試劑盒中的所有試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心
后使用。所涉及的酶類使用后應(yīng)盡快放回-20℃，避免反復(fù)凍融。
4．若起始RNA的量小于50 ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提
供，如需要可單獨(dú)向本公司訂購(gòu)，貨號(hào)：YJ0596。
使用方法
注意：10 ng-5 μg總RNA可建立20 μl反應(yīng)體系，如果總RNA量大于5 μg，請(qǐng)按比例擴(kuò)大反應(yīng)體系。
i逆轉(zhuǎn)錄操作步驟：
1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water
溶解并置于冰上備用。
2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為20 μl。
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4μl 500 μM Each
Primer Mix 2μl
RNA Template Xμl 1 ng-5 µg
5×RT Buffer 4μl 1×
DTT，0.1 M 2μl 10 mM
HiFi-MMLV，200 U/μl 1 μl
RNase-Free Water up to 20 μl
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨(dú)向本公司訂購(gòu)，貨號(hào)：K0596。
2）Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
3．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
4．42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
5．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20℃長(zhǎng)期保存。
ii 若逆轉(zhuǎn)錄效率低，或RNA模板二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、GC含量高時(shí)，建議采用以下步驟：
1．將RNA模板、引物、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和RNase-Free Water
溶解并置于冰上備用。
2．根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為13 μl。
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
dNTP Mix，2.5 mM Each 4 μl 500 μM Each
Primer Mix 2 μl
RNA Template X μl 1 ng-5 µg
RNase-Free Water up to 13 μl
3．70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。
4．短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．繼續(xù)向以上反應(yīng)液中加入以下試劑：
試劑 20 μl反應(yīng)體系 終濃度
5×RT Buffer 4 μl 1×
DTT，0.1 M 2 μl 10 mM
注意：1）若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提供，如需要可單獨(dú)向本公司訂購(gòu)，貨號(hào)：YJ0596。
2）Primer Mix由Oligo（dT）和Random primer配制而成。
6．輕輕吹打混勻，42℃孵育2分鐘。
7．加入1 μl HiFi-MMLV（200 U/μl），輕輕吸打混勻。42℃孵育50分鐘。
8．85℃孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
9．逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20℃長(zhǎng)期保存。
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